核酸雜交技術(shù)是根據(jù)兩條互補(bǔ)的核苷酸單鏈可以雜交結(jié)合成雙鏈的原理所建立，用一段已知序列的放射性或非放射性標(biāo)記的核苷酸單鏈做探針，與待檢標(biāo)本中的DNA雜交來(lái)探查待檢標(biāo)本中有無(wú)與之相互補(bǔ)的核酸。該方法特異性高，但敏感性低于PCR方法。
本實(shí)驗(yàn)學(xué)習(xí)用非放射性標(biāo)記物-地高辛(DIG)標(biāo)記DNA片段作探針，用斑點(diǎn)雜交法檢測(cè)病原微生物DNA的方法。
【原理】—核酸雜交法檢測(cè)病原微生物
用地高辛（DIG）類固醇半抗原標(biāo)記特異DNA片段做探針，與待檢標(biāo)本中DNA雜交，然后加入堿性磷酸酶標(biāo)記的抗－DIG抗體（抗DIG-AP），再加入堿性磷酸酶的作用底物（NBT/BCIP），若待檢標(biāo)本中有與探針同源的DNA序列，則探針與其雜交并與抗DIG-AP結(jié)合，堿性磷酸酶催化底物呈色，則在雜交膜上出現(xiàn)蘭色斑點(diǎn)或條帶。該探針可用于斑點(diǎn)雜交，菌落原位雜交及Southern blot雜交。
?。ㄒ唬〥IG-DNA探針的制備（隨機(jī)引物法標(biāo)記）
【材料】
1．待標(biāo)記DNA (0.5~3ug)
2．六核苷酸混合物 ( hexanucleotide mix)
3．dNTP標(biāo)記混合物，Klenow enzyme
4．其它試劑4M LiCl，無(wú)水乙醇，TE溶液（10mMTris-HCl，lmM EDTA PH8.0）；0.2M EDTA pH8.0
【方法】
1．取待標(biāo)記DNA(0.5~3ug)，加無(wú)菌去離子水至終體積15ul，于沸水浴變性10分鐘后迅速置冰／氯化鈉中冷卻。
2．在冰／氯化鈉上添加：
2ul 六核苷酸混合物( hexanucleotide mix)
2ul dNTP mix
1ul Klenow enzyme
3．混勻并短暫離心，然后于37℃孵育至少60分鐘。
4．加入2ul 0.2M EDTA，pH8.0以中止反應(yīng)。
5．加入2.5ul 4M LiCl及75ul經(jīng)-20℃預(yù)冷的無(wú)水乙醇，充分混勻， -70℃放置30分鐘或-20℃放置2h。
6．12000rpm/min離心15min，用50ul預(yù)冷的70％乙醇洗滌沉淀物。
7．真空短暫干燥，用50ulTE溶液溶解沉淀。
【說(shuō)明】
DIG標(biāo)記的DNA片斷大小為200~1000bp。每次標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)記反應(yīng)模板DNA量為0.5~3ug，如標(biāo)記大量DNA需相應(yīng)增加反應(yīng)物和反應(yīng)體積。若延長(zhǎng)37℃孵育時(shí)間(到20h)可增加DIG標(biāo)記產(chǎn)物量。
（二）斑點(diǎn)雜交法
【材料】
1．硝酸纖維素膜，待檢標(biāo)本DNA
2．標(biāo)準(zhǔn)預(yù)雜交液（5× SSC；0.1％月桂酸；0.02％SDS；1／10體積的10倍濃縮阻斷液(含變性并剪切的鮭精DNA)。
3．洗液1（2×SSC，0.1%SDS）; 洗液2 (0.1×SSC，0.1 %SDS)。
【方法】
1．雜交膜的制備
?、賹拇龣z標(biāo)本提取的核酸（質(zhì)粒或 染色體DNA）100℃ 10 min 煮沸變性，迅速置冰／氯化鈉中冷卻。
?、谀さ奶幚恚河?×SSC ，濕潤(rùn)均勻，37℃烘干后，即可點(diǎn)樣
?、埸c(diǎn)樣：取變性待檢核酸1ul 點(diǎn)在硝酸纖維素膜（0.45um）上，同 時(shí)設(shè)陽(yáng)性和陰性對(duì)照，室溫干燥。
④80℃真空干燥2h，將DNA固定于膜上。
2．預(yù)雜交及雜交
?、兕A(yù)雜交：將雜交膜放入裝有適當(dāng)體積預(yù)熱的標(biāo)準(zhǔn)預(yù)雜交液的雜交 袋或雜交杯中 ，37℃預(yù)雜交 30分鐘，輕輕攪拌使膜在該溫度下孵育。
②將DIG標(biāo)記的DNA探針置沸水浴5min后，迅速用冰水冷卻以變 性DNA探針。
?、蹖⒆冃缘腄IG標(biāo)記DNA探針加入到預(yù)熱的標(biāo)準(zhǔn)預(yù)雜交液(2.5ml／ cm2)中并充分混勻。
?、軐㈦s交膜放到含DIG標(biāo)記探針的雜交液中。輕輕攪拌，在68℃ 孵育至少6h（對(duì)于檢測(cè)微量DNA中的單拷貝基因則需孵育16h）。
?、蓦s交后洗滌：用足夠量的2×SSC，0.1%SDS室溫漂洗2次，每次5min；用0.1×SSC，0.1%SDS 68℃漂洗2次，每次15min，漂洗過(guò)程中需不斷輕輕攪拌。
（三）**學(xué)檢測(cè)—核酸雜交法檢測(cè)病原微生物
【材料】
1．馬來(lái)酸緩沖液（0.1M馬來(lái)酸，0.15M Nacl。pH7.5）
2．洗液（馬來(lái)酸緩沖液加入0.3％吐溫20(v/v)）
3．阻斷液（10×濃縮的阻斷液經(jīng)馬來(lái)酸緩沖液10倍稀釋，新鮮配制）
4．檢測(cè)液（lM Tri s-HCl，0.1MNaCl，50mM Mgcl2，pH9.5（20℃預(yù)熱）
5．顯色基底液（加200ul NBT/BCIP濃縮液到10ml檢測(cè)液中，新鮮配制）
【方法】
1．將經(jīng)過(guò)雜交和嚴(yán)格清洗后的膜用馬來(lái)酸緩沖液漂洗1~5min；將膜在l00ul阻斷液中孵育30min。
2．用阻斷液稀釋抗D1G抗體至適宜濃度(1：5000左右)。
3．傾出封閉液，將膜在20ml抗DIG抗體溶液中孵育膜30min；馬來(lái)酸緩沖液洗膜2次，每次15min，再用2m1檢測(cè)液平衡膜2~5min。
4．將雜交膜在現(xiàn)配制的顯色基底液中孵育，并用塑料袋或盒在暗室中密閉保存（顯色過(guò)程中不能搖動(dòng)）。
5．幾分鐘內(nèi)可有顏色沉淀形成（16h完成反應(yīng)，反應(yīng)過(guò)程中可短暫暴露于陽(yáng)光下以觀察反應(yīng)進(jìn)展）。
6．當(dāng)顏色斑點(diǎn)（或條帶）達(dá)到一定強(qiáng)度后，可用50ml去離子水或TE溶液洗膜5min以中止反應(yīng)。
7．顯色后的濾膜可封存于聚乙烯袋內(nèi)或拍照片保存。
