微生物的分離純化及稀釋平板菌落計數
一、實驗原理
稀釋平板測數是根據微生物在高度稀釋條件下固體培養基上所形成的單個菌落是由一個單細胞繁殖而成這一培養特征設計的計數方法，即一個菌落代表一個單細胞。計數時，首先將待測樣品制成均勻的繁殖稀釋液，盡量使樣品中的微生物細胞分散開，使其成單個細胞存在，否則一個菌落就不只是代表一個細胞，再取一定稀釋度、一定量的稀釋液接種到平板中，使其均勻分布于平板中的培養基內。經培養后，由單個細胞生長繁殖形成菌落，統計菌落數目，即可計算出樣品中的含菌數。此記數方法所計算的菌數是培養基上長出來的菌落數，故又稱活菌計數。一般用于某些產品檢定，如根瘤菌劑等產品檢定，生物制品檢驗，土壤含菌量測定及食品、水源的污染程度的檢驗。
自然條件下，微生物常以群落狀態存在，這種群落往往是不同種類微生物的混合體。為了研究某種微生物的特性或者要大量培養和使用某種微生物，必須從這些混雜的微生物群落中獲得純培養，這種獲得純培養的方法稱為微生物的分離與純化。
在自然界中，土壤是微生物生活的良好環境，其中生活的微生物數量和種類都是極其豐富的，因此土壤是人類開發利用微生物資源的重要基地。土壤中的微生物數量、種類與土壤肥力有關，肥沃的土壤中多，貧瘠土壤中少。其生理類群則與土壤的其它理化性質，如通氣、pH有關，例如在通氣良好的菜園土中，好氣性微生物占有**優勢。本實驗以菜園土為材料分離土壤中的好氣性細菌，并進行數量測定。
分離微生物時，一般是根據該微生物對營養、pH、氧氣等要求的不同，供給它們適宜的生活條件，或加入某種抑制劑造成只利于該菌種生長，不利于其它菌種生長的環境，從而淘汰不需要的菌種。分離微生物常用的方法有稀釋平板分離法和劃線分離法，根據不同的材料，可以采用不同方法，其*終目的是要在培養基上出現欲分離微生物的單個菌落，必要時再對單個菌落進一步分離純化。在用稀釋平板分離微生物時，還可以同時測定待分離的微生物的數量。
放線菌與細菌同屬原核微生物，是重要的***產生菌，在土壤中的數量僅次于細菌，尤其是在有機質豐富、透氣性好的中性到微堿性土壤中的數量較多。本實驗采用高氏一號瓊脂培養基分離和計數菜園土中的放線菌。
**在土壤中的數量次于細菌和放線菌，主要在有機質豐富、透氣性好的偏酸性土壤中較多。分離土壤中的**并不難，但由于其菌落大，容易擴展，計數準確性較低。本實驗采用加有氯霉素或慶大霉素和孟加拉紅的馬丁氏培養基分離及計數菜園土中的**。按一般資料介紹為鏈霉素，但此種***要先配成一定濃度的溶液，且應于倒平板前才加入培養基中。在此培養基上，放線菌和細菌被氯霉素或慶大霉素和孟加拉紅所抑制，但大多數**能夠生存，且其菌落受孟加拉紅的抑制而較小，從而避免了某些**的擴散蔓延而帶來的數量上的誤差。
二、實驗材料
1、活材料：蘇云金芽胞桿菌（Bacillus thuringiensis）菌劑。
2、培養基：牛肉膏蛋白胨瓊脂培養基；高氏一號瓊脂培養基；加有氯霉素（或慶大霉素）和孟加拉紅的馬丁氏瓊脂培養基:在1000mL培養基中加入注射用氯霉素2mL，孟加拉紅33.4mg，均于**前加入。
3、材料：肥沃茶園土。
實驗用品
內裝15～20個玻璃珠的90mL無菌水、9mL無菌水、直徑9cm的無菌平皿、1mL無菌吸管、天平、稱樣瓶、記號筆、玻璃刮鏟、經2mm土壤篩過篩的菜園、天平、試管架、無菌稱量紙、酒精燈、火柴、接種環、無菌水。
三、實驗方法
（一）稀釋平板測數法
1、樣品稀釋液的制備
準確稱取待測樣品10g，放入裝有90mL無菌水并放有小玻璃珠的250mL三角瓶中，用手或置搖床上振蕩20min，使微生物細胞分散，靜置20～30s，即成10－1稀釋液；再用1mL無菌吸管，吸取10－1稀釋液1mL，移入裝有9mL無菌水的試管中，吹吸3次，讓菌液混合均勻，即成10－2稀釋液；再換一支無菌吸管，吸取10－2稀釋液1mL，移入裝有9mL無菌水的試管中，也吹吸3次，即成10－3稀釋液；以此類推，連續稀釋，制成10－4、10－5、10－6、10－7、10－8、10－9等一系列稀釋菌液。
用稀釋平板計數時，待測菌稀釋度的選擇應根據樣品確定。樣品中所含待測菌的數量多時，稀釋度應高，反之則低。通常測定細菌菌劑含菌數時，采用10－7、10－8、10－9稀釋度，測定土壤細菌數量時，采用10－4、10－5、10－6稀釋度，測定放線菌數量時，采用10－3、10－4、10－5稀釋度，測定**數量時，采用10－2、10－3、10－4稀釋度。
2、平板接種培養
平板接種培養有混合平板培養法和涂抹平板培養法兩種方法。
⑴混合平板培養法
將無菌平板編上10－7、10－8、10－9號碼，每一號碼設置三個重復，用無菌吸管按無菌操作要求吸取1×10－9稀釋液各1mL放入編號10－9的3個平板中，同法吸取10－8稀釋液各1mL放入編號1×10－8的3個平板中，再吸取1×10－7稀釋液各1mL放入編號1×10－7的3個平板中，由低濃度向高濃度時，吸管可不必更換。然后在9個平板中分別倒入已熔化并冷卻至45～50℃的細菌培養基，輕輕轉動平板，使菌液與培養基混合均勻，冷凝后倒置，在30℃下培養。至菌落長出后即可計數。
⑵涂抹平板計數法
涂抹平板計數法與混合法基本相同，所不同的是先將培養基熔化后趁熱倒入無菌平板中，待凝固后編號，然后用無菌吸管吸取0.1mL菌液對號接種在不同稀釋度編號的瓊脂平板上，每個編號設三個重復。再用無菌刮鏟將菌液在平板上涂抹均勻，每個稀釋度用一個**刮鏟，更換稀釋度時需將刮鏟灼燒**。在由低濃度向高濃度涂抹時，也可以不更換刮鏟。將涂抹好的平板平放于桌上20～30min，使菌液滲透入培養基內，然后將平板倒轉，保溫培養，至菌落長出后即可計數。
（二）土壤中好氣性細菌的分離與計數
1、土壤稀釋液的制備
按“稀釋平板測數法”的相同步驟進行，按無菌操作法將土壤稀釋至10－6即可。
2、分離方法
可以用三種方法進行分離。
⑴混菌法：按“稀釋平板測數法”中的“混合平板培養法”進行，使用的稀釋度為10－4、10－4、10－6三個，各做3個重復。
⑵涂抹法：按“稀釋平板測數法”中的“涂抹平板測數法”進行，使用的稀釋度為10－3、10－4、10－5三個，各做3個重復。
以上兩法又統稱為稀釋平板分離法，可同時用于所分離菌的計數。
⑶劃線法：用**接種環沾取10-1稀釋液1環于已凝固的平板上進行劃線（圖示）。劃線可按以下兩種方式進行，一種為交叉劃線法，是在平板的一邊做**次“Z”字形劃線。轉動培養皿70°角，將接種環在火上燒過并冷卻后，通過**次劃線部分，做**次“Z”字形劃線。同法進行第三次、第四次劃線。另一種為邊疆劃線法，是從平板邊緣的一點開始，連續作緊密的波浪式劃線，直至平板中央。轉動培養皿180°，再從平板另一邊（不燒接種環）同樣劃線至平板中央。劃線法實質上屬于一種“由點到線”的稀釋法，較適用于含菌比較單一的材料的純化，對于土壤這類微生物高度混雜的樣品則較少使用。
以上各種分離法，都應按無菌操作進行。所用的培養基若在倒平板前，按50μg/m L 的量加入用乙醇溶解的制霉菌素或放線菌酮（起抑制霉菌的作用），效果會更好。
3、培養
將上述接種過土壤懸液的平板倒置，于28～30℃培養，至長出菌落為止（24～36h）。
4、挑菌純化
在平板上選擇分離較好的有代表性的單菌落接種斜面，同時作涂片檢查，若發現不純，應挑取此菌落做進一步劃線分離，或制成菌懸液再做稀釋分離，直至獲得純培養體。
5、計數
選取混菌法和涂抹法中每皿菌落數30～300的平板，分別按“稀釋平板測數法”中的“混合平板測數法”和“涂抹平板測數法”中的公式計數。這樣求得的是每克原始土樣中的活菌數，若要折算為每克干土的含菌數，還應將此數值除以干土在土樣中所占的質量分數(烘干土的質量/原土樣的質量)。
注：土壤含水量的測定是將一定質量的土壤在105～110℃下烘干至恒重，再稱干重。
（三）、土壤中放線菌的分離與計數
1、土壤稀釋液的制備
按實驗“稀釋平板計數法”中的方法進行，將菜園土稀釋至10－5。在稀釋時，可在盛無菌水的三角瓶中加10滴100g/L的石炭酸溶液和50μg/m L 的制霉菌素以抑制細菌和霉菌的生長。
2、分離方法
采用稀釋平板分離法，又可分為兩種方法。
⑴混菌法：按“稀釋平板計數法”中的“混合平板培養法”進行，所不同者是稀釋度，應采用10－3、10－4、10－5三個稀釋度，各做3個重復。
⑵涂抹法：按“稀釋平板計數法”中的“涂抹平板計數法”進行，應采用10－2、10－3、10－4三個稀釋度，各做3個重復。
3、培養
將上述接種過土壤懸液的平板倒置于28～30℃培養4～5d。
4、挑菌純化
從平板中選擇分離較好的放線菌菌落（應與細菌菌落區別開）較接斜面，并制片作純度檢查，若不純，應進一步將該菌作稀釋平板分離或劃線分離，直至獲得純培養。
（四）、土壤中**的分離純化與計數
1、土壤稀釋液的制備
按實驗“稀釋平板計數法”中的方法進行，將土樣稀釋至10－4。
2、分離方法
采用稀釋平板分離法。又可分為兩種方法。
⑴混菌法：按“稀釋平板計數法”中的“混合平板培養法”進行，所不同的是稀釋度，應選10-2、10－3、10－4三個稀釋度進行接種。
⑵涂抹法：按“稀釋平板計數法”中的“涂抹平板計數法”進行，所不同的是稀釋度，應選10-1、10－2、10－3三個稀釋度進行接種。
3、培養
將上述接種土壤懸液的平板倒置于28℃培養3～5d。
4、挑菌純化
從長有單菌落的平板中選取典型的**菌落（包括酵母菌菌落）轉接斜面，并同時制片作純度檢查。若不純，應進一步挑取該菌落采用劃線分離，或制成菌懸液進一步作稀釋分離，直至獲得純培養體為止。
5、計數
選取每皿菌落數在10～100之間的平板用于計數。不應遺漏酵母菌的菌落，必要時可制片檢查，以免誤為細菌菌落，具體方法見土壤中好氣性細菌的分離與計數。
6、菌種保存
將分離到的**轉接到PDA斜面上培養，待長好后，置于冰籍中保存，必要時進行深入研究。