《食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)》

本標(biāo)準(zhǔn)代替GB/T 4789.10-2008《食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn) 金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)》和

GB/T 4789.37-2008《食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn) 金黃色葡萄球菌計(jì)數(shù)》。

本標(biāo)準(zhǔn)與GB/T 4789.10-2008 和GB/T 4789.37-2008 相比，主要修改如下：

——修改了標(biāo)準(zhǔn)的中英文名稱；

——修改了范圍；

——規(guī)范了樣品制備過(guò)程；

——增加了計(jì)算公式中系數(shù)1.1 的解釋；

——修改了附錄A 中胰酪胨大豆肉湯的名稱，規(guī)范為10%氯化鈉胰酪胨大豆肉湯；

——增加了**法金黃色葡萄球菌 Baird-Parker 平板計(jì)數(shù)和第三法金黃色葡萄球菌MPN 計(jì)數(shù)。

本標(biāo)準(zhǔn)的附錄A、附錄B、附錄C 是規(guī)范性附錄。

本標(biāo)準(zhǔn)所代替標(biāo)準(zhǔn)的歷次版本發(fā)布情況為：

——GB 4789.10-84、GB 4789.10-1994、GB/T 4789.10-2003、GB/T 4789.10-2008。

——GB/T 4789.37-2008。

1 范圍

本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了食品中金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）的檢驗(yàn)方法。

本標(biāo)準(zhǔn)**法適用于食品中金黃色葡萄球菌的定性檢驗(yàn)；**法適用于金黃色葡萄球菌含量較高的食品中金黃色葡萄球菌的計(jì)數(shù)；第三法適用于金黃色葡萄球菌含量較低而雜菌含量較高的食品中金黃色葡萄球菌的計(jì)數(shù)。

2 設(shè)備和材料

除微生物實(shí)驗(yàn)室常規(guī)**及培養(yǎng)設(shè)備外，其他設(shè)備和材料如下：

2.1 恒溫培養(yǎng)箱：36 ℃±1 ℃。

2.2 冰箱：2 ℃～5 ℃。

2.3 恒溫水浴箱：37 ℃～65 ℃。

2.4 天平：感量0.1 g。

2.5 均質(zhì)器。

2.6 振蕩器。

2.7 無(wú)菌吸管：1 mL（具0.01 mL 刻度）、10 mL（具0.1 mL 刻度）或微量移液器及吸頭。

2.8 無(wú)菌錐形瓶：容量100 mL、500 mL。

2.9 無(wú)菌培養(yǎng)皿：直徑90 mm。

2.10 注射器：0.5 mL。

2.11 pH 計(jì)或pH 比色管或精密pH 試紙。

3 培養(yǎng)基和試劑

3.1 10 %氯化鈉胰酪胨大豆肉湯：見(jiàn)附錄A 中A.1。

3.2 7.5 %氯化鈉肉湯：見(jiàn)附錄A 中A.2。

3.3 血瓊脂平板：見(jiàn)附錄A 中A.3。

3.4 Baird-Parker 瓊脂平板：見(jiàn)附錄A 中A.4。

3.5 腦心浸出液肉湯(BHI) ：見(jiàn)附錄A 中A.5。

3.6 兔血漿：見(jiàn)附錄A 中A.6。

3.7 稀釋液：磷酸鹽緩沖液：見(jiàn)附錄A 中A.7。

3.8 營(yíng)養(yǎng)瓊脂小斜面：見(jiàn)附錄A 中A.8。

3.9 革蘭氏染色液：見(jiàn)附錄A 中A.9。

3.10 無(wú)菌生理鹽水：見(jiàn)附錄A 中A.10。

4 檢驗(yàn)程序

金黃色葡萄球菌定性檢驗(yàn)程序見(jiàn)圖1。

5 操作步驟

5.1 樣品的處理

稱取25 g 樣品至盛有225 mL 7.5 %氯化鈉肉湯或10 %氯化鈉胰酪胨大豆肉湯的無(wú)菌均質(zhì)杯內(nèi)，8000 r/min～10000 r/min 均質(zhì)1 min～2 min，或放入盛有225 mL 7.5 %氯化鈉肉湯或10 %氯化鈉胰酪胨大豆肉湯的無(wú)菌均質(zhì)袋中，用拍擊式均質(zhì)器拍打1 min～2 min。若樣品為液態(tài)，吸取25 mL 樣品至盛有225 mL 7.5 %氯化鈉肉湯或10 %氯化鈉胰酪胨大豆肉湯的無(wú)菌錐形瓶(瓶?jī)?nèi)可預(yù)置適當(dāng)數(shù)量的無(wú)菌玻璃珠)中，振蕩混勻。

5.2 增菌和分離培養(yǎng)

5.2.1 將上述樣品勻液于36 ℃±1 ℃培養(yǎng)18 h～24 h。金黃色葡萄球菌在7.5%氯化鈉肉湯中呈混濁生長(zhǎng)，污染嚴(yán)重時(shí)在10%氯化鈉胰酪胨大豆肉湯內(nèi)呈混濁生長(zhǎng)。

5.2.2 將上述培養(yǎng)物，分別劃線接種到Baird-Parker 平板和血平板，血平板36 ℃±1 ℃培養(yǎng)18 h～24 h。Baird-Parker 平板36 ℃±1 ℃培養(yǎng)18 h～24 h 或45 h～48 h。

5.2.3 金黃色葡萄球菌在Baird-Parker 平板上，菌落直徑為2 mm～3 mm，顏色呈灰色到黑色，邊緣為淡色，周圍為一混濁帶，在其外層有一透明圈。用接種針接觸菌落有似奶油至樹(shù)膠樣的硬度，偶然會(huì)遇到非脂肪溶解的類似菌落；但無(wú)混濁帶及透明圈。長(zhǎng)期保存的冷凍或干燥食品中所分離的菌落比典型菌落所產(chǎn)生的黑色較淡些，外觀可能粗糙并干燥。在血平板上，形成菌落較大，圓形、光滑凸起、濕潤(rùn)、金黃色（有時(shí)為白色），菌落周圍可見(jiàn)完全透明溶血圈。挑取上述菌落進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢及血漿凝固酶試驗(yàn)。

5.3 鑒定

5.3.1 染色鏡檢：金黃色葡萄球菌為革蘭氏陽(yáng)性球菌，排列呈葡萄球狀，無(wú)芽胞，無(wú)莢膜，直徑約為0.5 μm～1 μm。

5.3.2 血漿凝固酶試驗(yàn)：挑取、Baird-Parker 平板或血平板上可疑菌落1 個(gè)或以上，分別接種到5 mL BHI和營(yíng)養(yǎng)瓊脂小斜面，36 ℃±1 ℃培養(yǎng)18 h～24 h。

取新鮮配置兔血漿0.5 mL，放入小試管中，再加入BHI 培養(yǎng)物0.2 mL～0.3 mL，振蕩搖勻，置36℃±1 ℃溫箱或水浴箱內(nèi)，每半小時(shí)觀察一次，觀察6 h，如呈現(xiàn)凝固（即將試管傾斜或倒置時(shí)，呈現(xiàn)凝塊）或凝固體積大于原體積的一半，被判定為陽(yáng)性結(jié)果。同時(shí)以血漿凝固酶試驗(yàn)陽(yáng)性和陰性葡萄球菌菌株的肉湯培養(yǎng)物作為對(duì)照。也可用商品化的試劑，按說(shuō)明書(shū)操作，進(jìn)行血漿凝固酶試驗(yàn)。結(jié)果如可疑，挑取營(yíng)養(yǎng)瓊脂小斜面的菌落到5 mL BHI，36 ℃±1 ℃培養(yǎng)18 h～48 h，重復(fù)試驗(yàn)。

5.4 葡萄球菌腸**的檢驗(yàn)

可疑食物中毒樣品或產(chǎn)生葡萄球菌腸**的金黃色葡萄球菌菌株的鑒定，應(yīng)按附錄B檢測(cè)葡萄球菌腸**。

6 結(jié)果與報(bào)告

6.1 結(jié)果判定：符合5.2.3、5.3，可判定為金黃色葡萄球菌。

6.2 結(jié)果報(bào)告：在25 g（mL）樣品中檢出或未檢出金黃色葡萄球菌。

 

 

 

 

 

 

 

7 檢驗(yàn)程序

金黃色葡萄球菌平板計(jì)數(shù)程序見(jiàn)圖2。

 

 

 

 

8 操作步驟

8.1 樣品的稀釋

8.1.1 固體和半固體樣品：稱取25 g樣品置盛有225 mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無(wú)菌均質(zhì)杯內(nèi)，8000r/min～10000 r/min均質(zhì)1 min～2 min，或置盛有225 mL稀釋液的無(wú)菌均質(zhì)袋中，用拍擊式均質(zhì)器拍打1min～2 min，制成1:10的樣品勻液。

8.1.2 液體樣品：以無(wú)菌吸管吸取25 mL樣品置盛有225 mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無(wú)菌錐形瓶(瓶?jī)?nèi)預(yù)置適當(dāng)數(shù)量的無(wú)菌玻璃珠)中，充分混勻，制成1:10的樣品勻液。

8.1.3 用1 mL 無(wú)菌吸管或微量移液器吸取1:10 樣品勻液1 mL，沿管壁緩慢注于盛有9 mL 稀釋液的無(wú)菌試管中（注意吸管或吸頭**不要觸及稀釋液面），振搖試管或換用1 支1 mL 無(wú)菌吸管反復(fù)吹打使其混合均勻，制成1:100 的樣品勻液。

8.1.4 按8.1.3 操作程序，制備10 倍系列稀釋樣品勻液。每遞增稀釋一次，換用1 次1 mL 無(wú)菌吸管或吸頭。

8.2 樣品的接種

根據(jù)對(duì)樣品污染狀況的估計(jì)，選擇2 個(gè)～3 個(gè)適宜稀釋度的樣品勻液（液體樣品可包括原液），在進(jìn)行10 倍遞增稀釋時(shí)，每個(gè)稀釋度分別吸取1 mL 樣品勻液以0.3 mL、0.3 mL、0.4 mL 接種量分別加入三塊Baird-Parker 平板，然后用無(wú)菌L 棒涂布整個(gè)平板，注意不要觸及平板邊緣。使用前，如Baird-Parker平板表面有水珠，可放在25 ℃～50 ℃的培養(yǎng)箱里干燥，直到平板表面的水珠消失。

8.3 培養(yǎng)

8.3.1.1 在通常情況下，涂布后，將平板靜置10 min，如樣液不易吸收，可將平板放在培養(yǎng)箱36 ℃±1℃培養(yǎng)1 h；等樣品勻液吸收后翻轉(zhuǎn)平皿，倒置于培養(yǎng)箱，36 ℃±1 ℃培養(yǎng)，45 h～48 h。

8.4 典型菌落計(jì)數(shù)和確認(rèn)

8.4.1 金黃色葡萄球菌在Baird-Parker 平板上，菌落直徑為2 mm～3 mm，顏色呈灰色到黑色，邊緣為淡色，周圍為一混濁帶，在其外層有一透明圈。用接種針接觸菌落有似奶油至樹(shù)膠樣的硬度，偶然會(huì)遇到非脂肪溶解的類似菌落；但無(wú)混濁帶及透明圈。長(zhǎng)期保存的冷凍或干燥食品中所分離的菌落比典型菌落所產(chǎn)生的黑色較淡些，外觀可能粗糙并干燥。

8.4.2 選擇有典型的金黃色葡萄球菌菌落的平板，且同一稀釋度3 個(gè)平板所有菌落數(shù)合計(jì)在20 CFU～200 CFU 之間的平板，計(jì)數(shù)典型菌落數(shù)。如果：

a）只有一個(gè)稀釋度平板的菌落數(shù)在20 CFU～200 CFU之間且有典型菌落，計(jì)數(shù)該稀釋度平板上的典型菌落；

b） *低稀釋度平板的菌落數(shù)小于20 CFU 且有典型菌落，計(jì)數(shù)該稀釋度平板上的典型菌落；

c）某一稀釋度平板的菌落數(shù)大于200 CFU 且有典型菌落，但下一稀釋度平板上沒(méi)有典型菌落，應(yīng)計(jì)數(shù)該稀釋度平板上的典型菌落；

d） 某一稀釋度平板的菌落數(shù)大于200 CFU 且有典型菌落，且下一稀釋度平板上有典型菌落，但其平板上的菌落數(shù)不在20 CFU～200 CFU 之間，應(yīng)計(jì)數(shù)該稀釋度平板上的典型菌落；

以上按公式（1）計(jì)算。

e） 2 個(gè)連續(xù)稀釋度的平板菌落數(shù)均在20 CFU～200 CFU 之間，按公式（2）計(jì)算。

8.4.3 從典型菌落中任選5 個(gè)菌落（小于5 個(gè)全選），分別按5.3.2 做血漿凝固酶試驗(yàn)。

9 結(jié)果計(jì)算：

公式（1）：

T = AB/CD ………………………………………………………………… （1）

式中：

T——樣品中金黃色葡萄球菌菌落數(shù)；

A——某一稀釋度典型菌落的總數(shù)；

B——某一稀釋度血漿凝固酶陽(yáng)性的菌落數(shù)；

C——某一稀釋度用于血漿凝固酶試驗(yàn)的菌落數(shù)；

d——稀釋因子。

公式（2）：

T=(A1B1/C1+A2B2/C2)/1.1d………………………（2）

式中：

T ——樣品中金黃色葡萄球菌菌落數(shù)；

A1——**稀釋度（低稀釋倍數(shù)）典型菌落的總數(shù)；

A2——**稀釋度（高稀釋倍數(shù)）典型菌落的總數(shù)；

B1——**稀釋度（低稀釋倍數(shù)）血漿凝固酶陽(yáng)性的菌落數(shù)；

B2——**稀釋度（高稀釋倍數(shù)）血漿凝固酶陽(yáng)性的菌落數(shù)；

C1——**稀釋度（低稀釋倍數(shù)）用于血漿凝固酶試驗(yàn)的菌落數(shù)；

C2——**稀釋度（高稀釋倍數(shù)）用于血漿凝固酶試驗(yàn)的菌落數(shù)；

1.1——計(jì)算系數(shù)；

d ——稀釋因子（**稀釋度）。

10 結(jié)果與報(bào)告

根據(jù)Baird-Parker平板上金黃色葡萄球菌的典型菌落數(shù)，按9中公式計(jì)算，報(bào)告每g（mL）樣品中金

黃色葡萄球菌數(shù)，以CFU/g(mL)表示；如T值為0，則以小于1乘以*低稀釋倍數(shù)報(bào)告。

 

11 檢驗(yàn)程序

金黃色葡萄球菌MPN計(jì)數(shù)程序見(jiàn)圖3。

 

12 操作步驟

12.1 樣品的稀釋

按8.1進(jìn)行。

12.2 接種和培養(yǎng)

12.2.1 根據(jù)對(duì)樣品污染狀況的估計(jì)，選擇3 個(gè)適宜稀釋度的樣品勻液（液體樣品可包括原液），在進(jìn)行10 倍遞增稀釋時(shí)，每個(gè)稀釋度分別吸取1 mL 樣品勻液接種到10%氯化鈉胰酪胨大豆肉湯管，每個(gè)稀釋度接種3管，將上述接種物于36 ℃±1 ℃培養(yǎng)45 h～48 h。

12.2.2 用接種環(huán)從有細(xì)菌生長(zhǎng)的各管中，移取1環(huán)，分別接種Baird-Parker平板，36 ℃±1 ℃培養(yǎng)45 h～48 h。

12.3 典型菌落確認(rèn)

12.3.1 見(jiàn)8.4.1。

12.3.2 從典型菌落中至少挑取1 個(gè)菌落接種到BHI肉湯和營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面，36 ℃±1 ℃培養(yǎng)18 h～24 h。進(jìn)行血漿凝固酶試驗(yàn)，見(jiàn)5.3.2。

13 結(jié)果與報(bào)告

計(jì)算血漿凝固酶試驗(yàn)陽(yáng)性菌落對(duì)應(yīng)的管數(shù)，查MPN 檢索表（見(jiàn)附錄C），報(bào)告每g(mL)樣品中金黃色葡萄球菌的*可能數(shù)，以MPN/g（mL）表示。

 

附錄A

（規(guī)范性附錄）

培養(yǎng)基和試劑

A.1 10%氯化鈉胰酪胨大豆肉湯

A.1.1 成分

胰酪胨（或胰蛋白胨） 17.0 g

植物蛋白胨（或大豆蛋白胨） 3.0 g

氯化鈉 100.0 g

磷酸氫二鉀 2.5 g

丙酮酸鈉 10.0 g

葡萄糖 2.5 g

蒸餾水 1 000 mL

pH 7.3±0.2

A.1.2 制法

將上述成分混合，加熱，輕輕攪拌并溶解，調(diào)節(jié)pH，分裝，每瓶225 mL，121 ℃高壓**15 min。

A.2 7.5%氯化鈉肉湯

A.2.1 成分

蛋白胨 10.0 g

牛肉膏 5.0 g

氯化鈉 75 g

蒸餾水 1 000 mL

pH 7.4

A.2.2 制法

將上述成分加熱溶解，調(diào)節(jié)pH，分裝，每瓶225 mL，121 ℃高壓**15 min。

A.3 血瓊脂平板

A.3.1 成分

豆粉瓊脂（pH7.4～7.6） 100 mL

脫纖維羊血（或兔血） 5 mL～10 mL

A.3.2 制法

加熱溶化瓊脂，冷卻至50 ℃，以無(wú)菌操作加入脫纖維羊血，搖勻，傾注平板。

A.4 Baird－Parker瓊脂平板

A.4.1 成分

胰蛋白胨 10.0 g

牛肉膏 5.0 g

酵母膏 1.0 g

丙酮酸鈉 10.0 g

甘氨酸 12.0 g

氯化鋰（LiCl·6H2O） 5.0 g

瓊脂 20.0 g

蒸餾水 950 mL

pH 7.0±0.2

A.4.2 增菌劑的配法

30%卵黃鹽水50 mL 與經(jīng)過(guò)**過(guò)濾的1%亞碲酸鉀溶液10 mL 混合，保存于冰箱內(nèi)。

A.4.3 制法

將各成分加到蒸餾水中，加熱煮沸至完全溶解，調(diào)節(jié)pH。分裝每瓶95 mL，121 ℃高壓**15 min。

臨用時(shí)加熱溶化瓊脂，冷至50 ℃，每95 mL 加入預(yù)熱至50 ℃的卵黃亞碲酸鉀增菌劑5 mL 搖勻后傾注

平板。培養(yǎng)基應(yīng)是致密不透明的。使用前在冰箱儲(chǔ)存不得超過(guò)48 h。

A.5 腦心浸出液肉湯(BHI)

A.5.1 成分

胰蛋白質(zhì)胨 10.0 g

氯化鈉 5.0 g

磷酸氫二鈉（Na2HPO4·12H2O） 2.5 g

葡萄糖 2.0 g

牛心浸出液 500 mL

pH 7.4±0.2

A.5.2 制法

加熱溶解，調(diào)節(jié)pH，分裝16 mm×160 mm 試管，每管5 mL 置121 ℃，15 min **。

A.6 兔血漿

取檸檬酸鈉3.8 g，加蒸餾水100 mL,溶解后過(guò)濾，裝瓶，121 ℃高壓**15 min。

兔血漿制備：取3.8%檸檬酸鈉溶液一份，加兔全血四份，混好靜置 (或以3000 r/min 離心30 min)，

使血液細(xì)胞下降，即可得血漿。

A.7 磷酸鹽緩沖液

A.7.1 成分：

磷酸二氫鉀（KH2PO4） 34.0 g

蒸餾水 500 mL

pH 7.2

A.7.2 制法：

貯存液：稱取34.0 g的磷酸二氫鉀溶于500 mL蒸餾水中，用大約175 mL的1 mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)

pH至7.2，用蒸餾水稀釋至1 000 mL后貯存于冰箱。

稀釋液：取貯存液1.25 mL，用蒸餾水稀釋至1 000 mL，分裝于適宜容器中，121 ℃高壓**15 min。

A.8 營(yíng)養(yǎng)瓊脂小斜面

A.8.1 成分

蛋白胨 10.0 g

牛肉膏 3.0 g

氯化鈉 5.0 g

瓊脂 15.0 g～20.0 g

蒸餾水 1 000 mL

pH 7.2～7.4

A.8.2 制法

將除瓊脂以外的各成分溶解于蒸餾水內(nèi)，加入15%氫氧化鈉溶液約2 mL調(diào)節(jié)pH至7.2～7.4。加入瓊

脂，加熱煮沸，使瓊脂溶化，分裝13 mm×130 mm管，121 ℃高壓**15 min。

A.9 革蘭氏染色液

A.9.1 結(jié)晶紫染色液

A.9.1.1 成分

結(jié)晶紫 1.0 g

95％乙醇 20.0 mL

1％草酸銨水溶液 80.0 mL

A.9.1.2 制法

將結(jié)晶紫完全溶解于乙醇中，然后與草酸銨溶液混合。

A.9.2 革蘭氏碘液

A.9.2.1 成分

碘 1.0 g

碘化鉀 2.0 g

蒸餾水 300 mL

A.9.2.2 制法

將碘與碘化鉀先行混合，加入蒸餾水少許充分振搖，待完全溶解后，再加蒸餾水至300 mL。

A.9.3 沙黃復(fù)染液

A.9.3.1 成分

沙黃 0.25 g

95％乙醇 10.0 mL

蒸餾水 90.0 mL

A.9.3.2 制法

將沙黃溶解于乙醇中，然后用蒸餾水稀釋。

A.9.4 染色法

a) 涂片在火焰上固定，滴加結(jié)晶紫染液，染 1 min，水洗。

b) 滴加革蘭氏碘液，作用 1 min，水洗。

c) 滴加 95％乙醇脫色約15 s～30 s，直至染色液被洗掉，不要過(guò)分脫色，水洗。

d) 滴加復(fù)染液，復(fù)染 1 min，水洗、待干、鏡檢。

A.10 無(wú)菌生理鹽水

A.10.1 成分

氯化鈉 8.5 g

蒸餾水 1 000 mL

A.10.2 制法

稱取8.5ｇ氯化鈉溶于1 000 mL蒸餾水中，121 ℃高壓**15 min。

 

 

附錄B

(規(guī)范性附錄)

葡萄球菌腸**檢驗(yàn)

B.1 試劑和材料

除另有規(guī)定外，所用試劑均為分析純，試驗(yàn)用水應(yīng)符合GB/T 6682對(duì)**水的規(guī)定。

B.1.1 A、B、C、D、E 型金黃色葡萄球菌腸**分型ELISA 檢測(cè)試劑盒。

B.1.2 pH 試紙，范圍在3.5～8.0，精度0.1。

B.1.3 0.25 mol/L、pH8.0 的Tris 緩沖液：將121.1g 的Tris 溶解到800mL 的去離子水中，待溫度冷至

室溫后，加42 mL 濃HCl，調(diào)pH 值至8.0。

B.1.4 pH 7.4 的磷酸鹽緩沖液：稱取NaH2PO4·H2O 0.55g（或NaH2PO4· 2H2O 0.62g）、Na2HPO4·2H2O

2.85g（或Na2HPO4·12H2O 5.73g）、NaCl 8.7g 溶于1 000 mL 蒸餾水中，充分混勻即可。

B.1.5 庚烷。

B.1.6 10%次氯酸鈉溶液。

B.1.7 腸**產(chǎn)毒培養(yǎng)基

B.1.7.1 成分

蛋白胨 20.0 g

胰消化酪蛋白 200 mg(氨基酸)

氯化鈉 5.0 g

磷酸氫二鉀 1.0 g

磷酸二氫鉀 1.0 g

氯化鈣 0.1 g

硫酸鎂 0.2 g

菸酸 0.01 g

蒸餾水 1 000 mL

pH7.2～7.4

B.1.7.2 制法

將所有成分混于水中，溶解后調(diào)節(jié)pH，121℃高壓**30min。

B.1.8 營(yíng)養(yǎng)瓊脂

B.1.8.1 成分

蛋白胨 10.0 g

牛肉膏 3.0 g

氯化鈉 5.0 g

瓊脂 15.0 g～20.0 g

蒸餾水 1 000 mL

B.1.8.2 制法

將除瓊脂以外的各成分溶解于蒸餾水內(nèi),加入15%氫氧化鈉溶液約2mL，校正pH 至7.2～7.4。加入瓊脂,加熱煮沸,使瓊脂溶化。分裝燒瓶,121℃高壓**15min。

B.2 儀器和設(shè)備

B.2.1 電子天平：感量0.01g。

B.2.2 均質(zhì)器。

B.2.3 離心機(jī)：轉(zhuǎn)速3000 g～5000 g。

B.2.4 離心管：50 mL。

B.2.5 濾器：濾膜孔徑0.2 μm。

B.2.6 微量加樣器:20 μL～200 μL、200 μL～1000 μL。

B.2.7 微量多通道加樣器:50 μL～300 μL。

B.2.8 自動(dòng)洗板機(jī)(可選擇使用)。

B.2.9 酶標(biāo)儀：波長(zhǎng)450 nm。

B.3 原理

本方法可用A、B、C、D、E 型金黃色葡萄球菌腸**分型酶聯(lián)**吸附試劑盒完成。本方法測(cè)定的基礎(chǔ)是酶聯(lián)**吸附反應(yīng)（ELISA）。96 孔酶標(biāo)板的每一個(gè)微孔條的A~E 孔分別包被了A、B、C、D、E 型葡萄球菌腸**抗體，H 孔為陽(yáng)性質(zhì)控，已包被混合型葡萄球菌腸**抗體，F(xiàn) 和G 孔為陰性質(zhì)控，包被了非**動(dòng)物的抗體。樣品中如果有葡萄球菌腸**，游離的葡萄球菌腸**則與各微孔中包被的特定抗體結(jié)合，形成抗原抗體復(fù)合物，其余未結(jié)合的成分在洗板過(guò)程中被洗掉；抗原抗體復(fù)合物再與過(guò)氧化物酶標(biāo)記物（二抗）結(jié)合，未結(jié)合上的酶標(biāo)記物在洗板過(guò)程中被洗掉；加入酶底物和顯色劑并孵育，酶標(biāo)記物上的酶催化底物分解，使無(wú)色的顯色劑變?yōu)樗{(lán)色；加入反應(yīng)終止液可使顏色由藍(lán)變黃，并終止

了酶反應(yīng)；以450 nm 波長(zhǎng)的酶標(biāo)儀測(cè)量微孔溶液的吸光度值，樣品中的葡萄球菌腸**與吸光度值成正比。

B.4 檢測(cè)步驟

B.4.1 從分離菌株培養(yǎng)物中檢測(cè)葡萄球菌腸**方法

待測(cè)菌株接種營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面（試管18 mm×180 mm）37 ℃培養(yǎng)24 h，用5 mL生理鹽水洗下菌落，傾入60 mL產(chǎn)毒培養(yǎng)基中，每個(gè)菌種種一瓶，37 ℃振蕩培養(yǎng)48 h，振速為100 次/min，吸出菌液離心，8000 r/min 20 min，加熱100 ℃，10 min，取上清液,取100 μL稀釋后的樣液進(jìn)行試驗(yàn)。

B.4.2 從食品中提取和檢測(cè)葡萄球菌**方法

B.4.2.1 乳和乳粉

將25 g 乳粉溶解到125 mL、0.25 mol/L、pH8.0 的Tris 緩沖液中，混勻后同液體乳一樣按以下步驟制備。將乳于15 ℃，3500 g 離心10 min。將表面形成的一層脂肪層移走，變成脫脂乳。用蒸餾水對(duì)其進(jìn)行稀釋（1：20）。取100μL 稀釋后的樣液進(jìn)行試驗(yàn)。

B.4.2.2 脂肪含量不超過(guò)40%的食品

稱取10 g 樣品絞碎，加入pH7.4 的PBS 液15 mL 進(jìn)行均質(zhì)。振搖15 min。于15℃，3500g 離心10min。必要時(shí)，移去上面脂肪層。取上清液進(jìn)行過(guò)濾**。取100 μL 的濾出液進(jìn)行試驗(yàn)。

B.4.2.3 脂肪含量超過(guò)40%的食品稱取10 g 樣品絞碎，加入pH7.4 的PBS 液15 mL 進(jìn)行均質(zhì)。振搖15 min。于15 ℃，3500 g 離心10 min。吸取5 mL 上層懸浮液，轉(zhuǎn)移到另外一個(gè)離心管中，再加入5 mL 的庚烷，充分混勻5 min。于15 ℃，3500 g 離心5 min。將上部有機(jī)相（庚烷層）全部棄去，注意該過(guò)程中不要?dú)埩舾椤⑾虏克鄬舆M(jìn)行過(guò)濾**。取100 μL 的濾出液進(jìn)行試驗(yàn)。

B.4.2.4 其它食品可酌情參考上述食品處理方法。

 

B.4.3 檢測(cè)

B.4.3.1 所有操作均應(yīng)在室溫（20 ℃~25 ℃）下進(jìn)行，A、B、C、D、E 型金黃色葡萄球菌腸**分型ELISA 檢測(cè)試劑盒中所有試劑的溫度均應(yīng)回升至室溫方可使用。測(cè)定中吸取不同的試劑和樣品溶液時(shí)應(yīng)更換吸頭，用過(guò)的吸頭以及廢液要浸泡到10 %次氯酸鈉溶液中過(guò)夜。

B.4.3.2 將所需數(shù)量的微孔條插入框架中（一個(gè)樣品需要一個(gè)微孔條）。將樣品液加入微孔條的A~G孔，每孔100 μL。H 孔加100 μL 的陽(yáng)性對(duì)照，用手輕拍微孔板充分混勻，用粘膠紙封住微孔以防溶液揮發(fā)，置室溫下孵育1 h。

B.4.3.3 將孔中液體傾倒至含10 %次氯酸鈉溶液的容器中，并在吸水紙上拍打幾次以確保孔內(nèi)不殘留液體。每孔用多通道加樣器注入250 μL 的洗液，再傾倒掉并在吸水紙上拍干。重復(fù)以上洗板操作4 次。本步驟也可由自動(dòng)洗板機(jī)完成。

B.4.3.4 每孔加入100μL 的酶標(biāo)抗體，用手輕拍微孔板充分混勻，置室溫下孵育1 h。

B.4.3.5 重復(fù)B.4.3.3 的洗板程序。

B.4.3.6 加50μL 的TMB 底物和50μL 的發(fā)色劑至每個(gè)微孔中，輕拍混勻，室溫黑暗避光處孵育30 min。

B.4.3.7 加入100μL 的2 mol/L 硫酸終止液，輕拍混勻，30 min 內(nèi)用酶標(biāo)儀在450 nm 波長(zhǎng)條件下測(cè)量每個(gè)微孔溶液的OD 值。

B.4.4 結(jié)果的計(jì)算和表述

B.4.4.1 質(zhì)量控制

測(cè)試結(jié)果陽(yáng)性質(zhì)控的OD 值要大于0.5，陰性質(zhì)控的OD 值要小于0.3，如果不能同時(shí)滿足以上要求，測(cè)試的結(jié)果不被認(rèn)可。對(duì)陽(yáng)性結(jié)果要排除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的干擾。

B.4.4.2 臨界值的計(jì)算

每一個(gè)微孔條的F 孔和G 孔為陰性質(zhì)控，兩個(gè)陰性質(zhì)控OD 值的平均值加上0.15 為臨界值。

示例：陰性質(zhì)控1=0.08

陰性質(zhì)控2=0.10

平均值=0.09

臨界值=0.09+0.15=0.24

B.4.4.3 結(jié)果表述

OD 值小于臨界值的樣品孔判為陰性，表述為樣品中未檢出某型金黃色葡萄球菌腸**；OD 值大于或等于臨界值的樣品孔判為陽(yáng)性，表述為樣品中檢出某型金黃色葡萄球菌腸**。

B.5 生物**

因樣品中不排除有其它潛在的傳染性物質(zhì)存在，所以要嚴(yán)格按照GB19489 對(duì)廢棄物進(jìn)行處理。

 

附錄C

（規(guī)范性附錄）

金黃色葡萄球菌*可能數(shù)（MPN）檢索表

C.1 金黃色葡萄球菌*可能數(shù)（MPN）的檢索見(jiàn)表

每g(mL)檢樣中金黃色葡萄球菌*可能數(shù)（MPN）的檢索見(jiàn)表C.1。