ＰＣＲ及其改進技術在食品微生物檢測中的應用
柳洪芳１，宋 慧２
（１．黑龍江省農墾科學院測試化驗中心，黑龍江佳木斯１５４００７；２．吉林農業大學生命科學學院）
摘要：簡述了ＰＣＲ及其幾種改進技術，并對其在食品微生物檢測中的應用進行綜述。
關鍵詞：ＰＣＲ改進技術；食品微生物；檢測
民以食為天，食以安為先。食品**是關系到人體健康和國計民生的重大問題。食品中的微生物是人類許多**發生的根源之一，隨著人們對食品**性認識的不斷提高，傳統的微生物檢測方法因檢測成本高、速度慢、效率低等問題，難以滿足現代社會快速檢測的要求。而ＰＣＲ及其改進技術以其特異性強、快速準確和靈敏度高等優點在食品微生物檢測領域得到廣泛的應用。
１ 常規ＰＣＲ技術及其在食品微生物檢測中的應用
多聚酶鏈式反應（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ．ＰＣＲ）是１９８５年美國的ＫＡＲＹ ＭＵＬＬＩＳ等人創建的一種在體外快速擴增特定基因或ＤＮＡ序列的方法，也稱基因的體外擴增法，其擴增過程包括以下３個步驟：①變性，即將模板雙鏈ＤＮＡ序列置于９５℃高溫下，使其變性解鏈成兩個單鏈模板。②退火，低溫（５０～６５℃）時，使人工合成的兩個引物與單鏈ＤＮＡ模板特異性地互補結合。③延伸，在適宜的溫度（７２℃）下，ＤＮＡ 聚合酶以單鏈ＤＮＡ 為模板，沿５，→３方向摻入核苷酸，使引物延伸合成模板的互補鏈，這就是新合成的ＤＮＡ雙鏈。新合成的ＤＮＡ雙鏈又可作為擴增的模板，繼續重復以上的ＤＮＡ多聚酶鏈反應程序，就使得ＤＮＡ 片斷得到有效的擴增。
ＰＣＲ技術具有快速、靈敏、操作方便等優點，早在１９９２年ＮＡＫＡ ＪＩＭＡ Ｈ［１］利用ＰＣＲ方法對病原菌進行檢測，而利用ＰＣＲ技術檢測食品中病原微生物到近些年來才比較廣泛應用。劉勝貴［２］等人利用ＰＣＲ技術檢測豬肉中沙門氏菌，對已知和未知被沙門氏菌污染的豬肉的培養物均能準確檢測。對不同稀釋度的樣品進行ＰＣＲ擴增，當ＤＮＡ含量只有０．０１ｐｇ時，還能擴增出條帶，說明該方法檢測豬肉中沙門氏菌具有特異性高且靈敏、快速等特點。巢國祥［３］等人通過ＰＣＲ法擴增ｈｌｙ基因建立快速檢
測單核細胞增生性李斯特氏菌（Ｌｍ）的方法。并檢測模擬污染生豬肉、水和牛奶，檢測限達１０ｃｆｕ／２５ｇ（ｍＬ）。該方法對Ｌｍ的鑒定具有特異性強、靈敏度高、速度快和易操作等優點，可用于食品的Ｌｍ的分離檢測。
２ ＰＣＲ改進技術在食品微生物檢測中的應用
隨著生物技術的飛速發展和各項新技術與ＰＣＲ技術的有機結合，衍生出一些ＰＣＲ改進技術。主要介紹實時熒光定量ＰＣＲ、多重ＰＣＲ、ＩＭＳ－ＰＣＲ、ＤＧＧＥ－ＰＣＲ等４種ＰＣＲ改進技術及其在食品微生物檢測中的應用。
２．１ 實時熒光定量ＰＣＲ技術及其在食品微生物檢測中的應用
實時熒光定量ＰＣＲ（Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＦｌｕｒｅｓｃｅｎｔＱｕａｎｔｉｔｉｖｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）技術，是指在ＰＣＲ反應體系中加入熒光染料或熒光探針，利用熒光信號積累實時監測整個ＰＣＲ進程，*后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。此技術于１９９６年由美國Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ公司推出，該技術實現了ＰＣＲ 從定性到定量的飛躍，除了具有常規ＰＣＲ的快速、靈敏、操作方便等特點外，還具有以下優點：全封閉反應，無需凝膠電泳等ＰＣＲ后處理，減小對環境的污染；不使用有毒試劑，操作**；定量準確；儀器在線實時監測，結果直觀。該技術的諸多優點使之在食品微生物的檢測中的應用越來越廣泛。李光偉［４］等針對沙門氏菌ｆｉｍＹ 基因，設計特異引物和探針，建立了檢測食品中沙門菌的ＲＴＱ－ＰＣＲ方法。其檢測靈敏度為１８０ｃｆｕ／ｍＬ，與國標法檢出的陽性樣本數基本保持一致，準確率達９９．７％。高虹［５］等建立了奶粉中阪崎腸桿菌ＲＴＱ－ＰＣＲ檢測方法。其所建立的方法特異性強，靈敏度高，在２．２～５．４ｃｆｕ／ｌ００ｇ范圍內線性關系良好；與ＦＤＡ方法比對實驗表明，兩種方法的檢測結果完全一致。翁文川［６］等人針對單增李斯特氏菌溶血素基因（ｈＩｙＡ），設計特異的引物ＴａｇＭａｎ探針，優化體系，建立了食品中單核細胞增生李斯特氏菌的熒光定量ＰＣＲ檢測方法，該方法檢測低限為１ｃｆｕ／ｇ，整個流程只需２７ｈ。與傳統方法進行對比，結果一致。Ｌｋｅｄａ［７］等根據金黃色葡萄球菌的ｓｅａ和ｎｕｃ基因設計引物，建立了脫脂奶粉中金黃色葡萄球菌的ＲＴＱ－ＰＣＲ檢測方法。
２．２ 多重ＰＣＲ技術及其在食品微生物檢測中的應用
多重ＰＣＲ是通過對普通ＰＣＲ技術的改進而建立起來的一種技術，是將多條引物和多條模板混合在一個反應體系中分別特異擴增不同的目的條帶，或者多條引物和單一的模板ＤＮＡ混合在同一反應體系中擴增同一模板的不同片斷，常用于對超長片斷的擴增。與常規的ＰＣＲ相比，還具有擴增效率高、產物特異性高和經濟簡便等特點，特別適合食品中多種致病菌的快速檢測。梁會營［８］等根據阪崎腸桿菌外膜蛋白Ａ（ｏｍｐＡ）基因和金黃色葡萄球菌耐熱核酸酶（ｎｕｃ）基因序列，設計兩對特異性引物，并優化了ＰＣＲ的條件，建立了嬰幼兒奶粉中常見病原菌的多重ＰＣＲ檢測方法。結果表明，該方法具有很高的特異性，混菌檢測靈敏度達到１０３ｃｆｕ／ｍＬ，為快速檢測奶粉中病原菌提供了有效手段。陳偉［９］等對金黃葡萄球菌的ｎｕｃ基因、單增李斯特菌的ｈｌｖ基因和蠟樣芽孢桿菌的ｈｅｍｏｌｙｓｉｎ基因設計了引物，建立了３種致病菌的多重ＰＣＲ檢測體系，結果顯示該方法檢測結果與單基因ＰＣＲ檢測的靈敏度相同，結果穩定。整個檢測過程在１６ｈ內完成，檢測靈敏度可達ｌｃｆｕ／ｍＬ。王艷君［１０］等人針對沙門氏菌編碼ＤＮＡ結合蛋白
的基因ｈｎｓ、大腸桿菌Ｏ１５７∶Ｈ７編碼外膜蛋白緊密素的基因ｅａｅＡ 和單核細胞增生李斯特氏菌溶血素Ｏ基因Ｈｌｙ設計３對引物，建立同步檢測肉制品中３種致病菌的多重ＰＣＲ方法。通過對多重ＰＣＲ特異性和靈敏度進行分析及對多重ＰＣＲ反應條件進行優化，結果表明，該方法簡便、快速，可使混菌檢測靈敏度達到１０３ｃｆｕ／ｍＬ。ＫＡＷＡＳＡＫＩＳ［１１］等人利用多重ＰＣＲ方法同時檢測肉類中的沙門菌、李斯特菌和大腸桿菌Ｏ１５７∶Ｈ７，通過ＵＰＢ增菌培養基增菌后檢測敏感性可達到１ｃｆｕ／２５ｇ。
２．３ ＩＭＳ－ＰＣＲ技術及其在食品微生物檢測中的應用
**磁珠技術（ｉｍｍｕｎｏｍａｇｎｅｔｉｃ ｂｅａｄｓ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）是２０世紀７０年代中期發展起來的一項新的**學檢測和分離技術。其原理是磁珠經過一定的處理后，可結合某種微生物特異性抗體，形成**磁珠。將這種帶有特異性抗體的**磁珠加到待測樣品中，相應的抗原物質就會和**磁珠上的抗體發生特異性結合，形成抗原－抗體－磁珠**復合物，此復合物在外加磁場的作用下發生定向移動，使復合物與其他物質分離，從而達到快速分離抗原物質的目的［１２］。該技術不僅具備了固相化試劑特有的優
點以及**學反應的高度特異性，還具有高效、快速、可重復性好、操作簡單和不需昂貴的儀器設備等優點。現已在細胞分離和培養、生物大分子純化、**學及微生物學檢測等領域得到了廣泛應用。該技術與ＰＣＲ結合，可大大縮短食品中致病菌檢測時間，同時也增加了檢測的特異性，克服ＰＣＲ檢測中易出現假陽性的弱點。近年來，ＩＭＳＰＣＲ技術已應用于食品微生物的檢測中。李敏［１３］等研究表明，將ＩＭＳ與多重ＰＣＲ結合，２４ｈ內即可檢出食品中的單增李斯特菌，*低檢測限可達１ｃｆｕ／２５ｇ（ｍＬ）。王曉聞［１４］等建立了沙門氏菌的磁捕獲－ＰＣＲ檢測方法，實驗包括前增菌、**磁珠制備分離、ＤＮＡ提取及ＰＣＲ擴增，７ｈ即可完成檢測過程，且檢測靈敏度為９ｃｆｕ／ｍＬ。結果表明該方法操作簡便、用時短、檢出率高。翁文川［１５］等應用抗李氏菌**磁珠從增菌肉湯中篩選和富集目的菌。通過熒光ＰＣＲ技術檢測李氏菌溶血素ｈｌｙＡ基因，建立了單增李斯特氏菌的**磁分離－熒光ＰＣＲ方法。該方法檢測肉類制品中單增李斯特氏菌簡便易行，可在２７ｈ內完成，特異性好，檢測低限為１ｃｆｕ／ｇ。
２．４ ＰＣＲ－ＤＧＧＥ技術及其在食品微生物檢測中的應用
ＰＣＲ－ＤＧＧＥ的技術是Ｓｈｅｆｆｉｅｌｄ等于１９８９年**提出的，將ＰＣＲ 和變性梯度凝膠電泳的（ＤＧＧＥ）分析技術結合起來是一種可將長度相同而序列不同的ＤＮＡ 片段混合物分離開的一項技術。ＤＧＧＥ的基本原理是：由于ＤＮＡ分子中４種堿基的組成和排列存在差異，造成不同序列的ＤＮＡ分子的解鏈溫度不同，解鏈時所需的變性劑
的濃度也不同。當雙鏈ＤＮＡ 分子在含梯度變性劑（尿素、甲酰胺）的聚丙烯酰胺凝膠中進行電泳時，會致使序列不同的ＤＮＡ片段會在各自相應的變性劑濃度下變性，從而使ＤＮＡ分子的遷移速度不斷下降，當產生的遷移阻力與電場力相對平衡時，不同序列的ＤＮＡ 片段滯留于凝膠的不同位置，形成相互分開的帶譜。理論上只要選擇的電泳條件足夠精細，有一個堿基差異的ＤＮＡ長段都可以被分開。ＰＣＲ－ＤＧＧＥ技術具有可檢測不可培養類細菌、檢測時間短、檢測率高、重復性好等優點。近些年來，此技術在食品中檢測微生物后應用也有報道。ＣＯＣＯＬＩＮ［１６］等建立一種直接檢測食品中李斯特菌屬的分子生物學方法。通過ＰＣＲ擴增李斯特菌和標準菌株的特異ｉａｐ基因，擴增產物再用ＤＧＧＥ進
行分離，鑒定出五種李斯特菌。李苗云［１７］等研究冷卻豬肉貯藏過程中的微生物變化，直接提取不同冷藏天數肉樣ＤＮＡ，對細菌１６ＳｒＤＮＡ的ｖ６－ｖ８區段進行ＰＣＲ 擴增，通過ＤＧＧＥ 及序列分析，結果表明，冷卻豬肉耗氧貯藏過程中的微生物主要有：熱殺索絲菌、莫拉氏菌、氣單胞菌、假單胞菌、葡萄球菌和節桿菌，為快速檢測冷卻豬肉中的微生物污染提供新思路。
總之，由于ＰＣＲ及其改進技術可以快速特異地擴增任何期望的ＤＮＡ 片斷和目的基因，使其在食品微生物檢測領域已有著實際的應用。但在實際應用中也表現出一些缺陷，例如由于引物之間的抑制或引物和其它模板間的非特異性結合可能導致出現假陽性；實驗條件不當可能導致產物產生突變；引物設計及靶序列選擇不當可能降低靈敏度和特異性等。盡管還存在著一定的問題，相信隨著ＰＣＲ及其改進技術的進一步發展和完善，ＰＣＲ及其改進技術在食品微生物檢測領域會有更加廣泛的應用，發揮更大的作用，必將把食品微生物檢測技術帶入一個新階段。