摘 要：糞大腸菌群是水體糞便污染的指示菌。詳細介紹了多管發(fā)酵法、濾膜法、紙片法、酶底物法及分子生物學(xué)
方法檢測糞大腸菌群的優(yōu)缺點及主要應(yīng)用實例。
關(guān)鍵詞：糞大腸菌群；多管發(fā)酵法；濾膜法；紙片法；酶底物法
糞
大腸菌群檢測方法研究進展
糞大腸菌群是一群能發(fā)酵乳糖、產(chǎn)酸產(chǎn)氣、需氧和兼性厭氧的革蘭氏陰性無芽胞桿菌。該菌主要來源于人畜糞便，是當前國內(nèi)、外環(huán)境監(jiān)測部門評價水體污染程度的公認指標和主要監(jiān)測項目之一，具有廣泛的衛(wèi)生學(xué)意義。**、快速、可靠的糞大腸菌群檢測方法對于準確及時地監(jiān)測水域糞大腸菌群的污染狀況，有效預(yù)報和控制流行**的發(fā)生與傳播有重要意義。
１ 糞大腸菌群的檢測方法
１．１ 多管發(fā)酵法
１．１．１ 原理
利用大腸菌群繁殖時使乳糖發(fā)酵，并能使乳糖蛋白胨培養(yǎng)液變黃，同時產(chǎn)生氣泡。
１．１．２ 檢測方法
１．１．２．１
水樣接種量將水樣充分混勻后，根據(jù)水樣污染的程度確定水樣接種量。每個樣品至少用３個不同的水樣量接種。同一接種水樣量要有５管。相對未受污染的水樣接種量為１０、１、０．１ｍＬ；受污染水樣接種量根據(jù)污染程度接種１、０．１、０．０１ｍＬ或０．１、０．０１、０．００１ｍＬ等。如接種體積為１０ｍＬ，則試管內(nèi)應(yīng)裝有３倍濃度乳糖蛋白胨培養(yǎng)液５ｍＬ；如接種量為１ｍＬ或少于１ｍＬ，則可接種于普通濃度的乳糖蛋白胨培養(yǎng)液１０ｍＬ中。
１．１．２．２
初發(fā)酵實驗將水樣分別接種到盛有乳糖蛋白胨培養(yǎng)液的發(fā)酵管中，在３７±０．５℃下培養(yǎng)２４±２ｈ。產(chǎn)酸和產(chǎn)氣的發(fā)酵管表明試驗陽性。如在倒管內(nèi)產(chǎn)氣不明顯，可輕拍試管，有小氣泡升起的為陽性。
１．１．２．３
復(fù)發(fā)酵實驗輕微振蕩初發(fā)酵試驗陽性結(jié)果的發(fā)酵管，用３ｍｍ接種環(huán)或**棒將培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接到ＥＣ培養(yǎng)液中。在４４．５±０．５℃水浴下培養(yǎng)２４±２ｈ。培養(yǎng)后立即觀察，若發(fā)酵管產(chǎn)氣，則表明確信試驗陽性。
１．１．２．４ 計算和報告結(jié)果
根據(jù)不同接種量的發(fā)酵管所表現(xiàn)陽性結(jié)果的數(shù)目，從ＭＰＮ表中查得相應(yīng)的ＭＰＮ 指數(shù)，計算每升水中糞大腸菌群數(shù)的*近似值（Ｍｏｓｔ ｐｒｏｂａｂｌｅｎｕｍｂｅｒ，ＭＰＮ）。
１．２ 濾膜法［１］（Ｍｅｍｂｒａｎｅ ｔｉｌｔｅｒ，ＭＦ）
１．２．１ 原理
將水樣注入已**的放有濾膜（孔徑為０．４５μｍ）的濾器中，經(jīng)過抽濾，細菌即被截留在膜上，然后將濾膜貼于Ｍ－ＦＣ培養(yǎng)基上，４４．５℃溫度下進行培養(yǎng)。
１．２．２ 檢測方法
１．２．２．１ 水樣抽濾
于濾器內(nèi)先加入約１０ｍＬ已**的去離子水，然后再用已**吸量管吸取一定量的充分混勻的待檢水樣，加入濾器中。在負壓５０ｋＰａ下進行抽濾，快濾完前加入**水少許以沖洗濾器內(nèi)壁，使水樣內(nèi)的細菌全部集中于濾膜上。
１．２．２．２ 細菌培養(yǎng)
用**鑷子夾取濾膜邊緣部分，移放在Ｍ－ＦＣ培養(yǎng)基上，濾膜截留細菌面向上，濾膜與培養(yǎng)基完全緊貼不能有氣泡，然后將平板倒置，置于４４．５±０．５℃的恒溫培養(yǎng)箱或恒溫水浴中，培養(yǎng)２４±２ｈ。
１．２．２．３ 計數(shù)和報告結(jié)果
糞大腸菌群菌落在Ｍ－ＦＣ培養(yǎng)基上呈藍色或藍綠色，其它非糞大腸菌群菌落呈灰色、淡黃色或無色。正常情況下，由于溫度和玫瑰酸鹽試劑的選擇性作用，在Ｍ－ＦＣ培養(yǎng)基上很少見到非糞大腸菌菌落。必要時可將可疑菌落接種于ＥＣ培養(yǎng)液，４４．５±０．５℃培養(yǎng)２４±２ｈ，如產(chǎn)氣則證實為糞大腸菌群。計數(shù)呈藍或藍綠色的菌落，計算出每１Ｌ水樣中的糞大腸菌群數(shù)。
１．３ 紙片法（Ｐａｐｅｒ ｓｔｒｉｐ ｍｅｔｈｏｄ）
１．３．１ 原理
紙片法是以紙片、紙膜、膠片等作為培養(yǎng)基載體，將特定的培養(yǎng)基和顯色物質(zhì)附著在上面，通過糞大腸菌群在上面的生長、顯色來測定的方法，即糞大腸菌在紙片培養(yǎng)基上呈紅色菌落，菌落周圍產(chǎn)生黃圈是糞大腸菌分解乳糖產(chǎn)酸使指示劑變色的結(jié)果。
１．３．２ 檢測方法
（１）將適量待測液加到紙片上后于４５℃培養(yǎng)１８～２４ｈ。
（２）觀察結(jié)果，根據(jù)陽性紙片張數(shù)，查ＭＰＮ 值表，報出結(jié)果。
１．４ 酶底物法（ＥＳＴ）
１．４．１ 原理
酶底物法是利用大腸菌群細菌能產(chǎn)生β－半乳糖苷酶（β－Ｄ－Ｇａｌａｅｔｏｓｉｄａｓｅ）分解ＰＧ（Ｏｒｔｈｏｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙ１－β－Ｄ－Ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）使培養(yǎng)液呈黃色，以及大腸埃希氏菌產(chǎn)生葡萄糖醛酸酶（１３－Ｇｌｕｅｕｒｏｎｉｄａｓｅ）分解ＭＵＧ（４－ｍｅｔｈＹ１－ｕｍｂｅｌｌｌｆｅｒｙ－β－ＤＧｌｕｃｕｒｏｎｉｄｅ）使培養(yǎng)液在波長３６６ｎｍ紫外光下產(chǎn)生熒光的原理，來定量分析水樣中糞大腸菌群數(shù)。
１．４．２ 檢測方法
酶底物法采用５１孔或９７孔定量盤法。檢測所需水樣為１００ｍＬ。
（１）用１００ｍＬ無菌稀釋瓶量取１００ｍＬ水樣，加入（２．７±０．５）ｇ ＭＭＯ－ＭＵＧ 培養(yǎng)基粉末，混搖均勻使之完全溶解，將水樣全部倒入５ｌ孔或９７孔無菌定量盤內(nèi)，以手撫平定量盤背面以趕除孔穴內(nèi)氣泡，然后用封口機封口。放入４４℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)２４ｈ。
（２）培養(yǎng)后進行結(jié)果判讀。如果孔穴內(nèi)的水樣變成黃色則表示該孔穴中含有大腸菌群。將定量盤在暗處用波長為３６６ｎｍ的紫外光燈照射，有黃色反應(yīng)的孔穴如果有藍色的熒光產(chǎn)生則表示該定量盤孔穴中含有大腸埃希氏菌。計算有黃色反應(yīng)及有熒光的孔穴數(shù)，對照ＭＰＮ 表查出其代表的糞大腸菌群*可能數(shù)。
１．５ 聚合酶鏈式技術(shù)（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ，
ＰＣＲ）
１．５．１ 原理
利用ＰＣＲ技術(shù)擴增編碼約２６０ｂｐ的ＬａｃＺ基因（β－半乳糖苷酶基因）和約１５０ｂｐ的Ｕｄｉ Ａ 基因（β－Ｄ－半乳糖苷酶基因）的ＤＮＡ 片段，可以分別檢
測大腸菌群數(shù)和大腸桿菌。
１．５．２ 檢測方法
（１）用適當方法提取糞大腸菌群混懸液和待測水樣的ＤＮＡ，提取的ＤＮＡ片段用紫外分光光度法測定純度和濃度。ＰＣＲ擴增反應(yīng)，包括變性、退火和延伸的多次循環(huán)，擴增產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。
（２）將糞大腸菌群混懸液和待測水樣的ＰＣＲ擴
增產(chǎn)物進行比較，根據(jù)ＤＮＡ分子量推算，確定水樣中糞大腸菌群數(shù)。
１．６ 熒光原位雜交技術(shù)（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，ＦＩＳＨ）
１．６．１ 原理
熒光原位雜交技術(shù)是根據(jù)糞大腸菌群特異的ＤＮＡ序列，以利用熒光標記的特異寡聚核苷酸片段作為探針，與待測水樣中ＤＮＡ分子雜交，經(jīng)熒光檢測體系在鏡下對待測ＤＮＡ進行定性、定量分析。
１．６．２ 檢測方法
（１）選擇專門針對糞大腸菌群的熒光標記探針序列，利用寡核苷酸探針與靶細胞專一性結(jié)合進行生物分析。基本實驗步驟為細胞固定、雜交、洗脫。
（２）雜交細胞通常用熒光顯微鏡檢測，利用流式細胞儀對每一個靶細胞的探針雜交物的熒光強度進行定量測定，然后確定菌群數(shù)。
２ 各種檢測方法的比較
多管發(fā)酵法和濾膜法是糞大腸菌群標準檢測方法，這２種方法檢測時間相對較長（４８～７２ｈ），需確認試驗，試驗步驟較為繁瑣，干擾因素多，不適于大量樣品的分析，也不能對水的衛(wèi)生學(xué)狀況做出快速評價。但標準方法具有費用較低、原理簡單、利于推廣的優(yōu)點，此仍是常規(guī)監(jiān)測中的主要檢測方法。紙片法和酶底物法，只需１８～２４ｈ培養(yǎng)即可報告結(jié)果，操作簡便，結(jié)果可靠，不需要確認試驗，酶底物法還可同時檢測水中大腸菌群和大腸埃希氏菌的污染狀況。紙片法是中國環(huán)境監(jiān)測總站推薦的試用方法，酶底物法已經(jīng)被世界各國國家及地方實驗室和世界各組織機構(gòu)認可，能夠較**地判斷水樣的微生物污染狀況，適宜污染事故應(yīng)急監(jiān)測。ＰＣＲ技術(shù)用于大腸菌群的檢測仍然處于研究階段，還有許多技術(shù)上的限制需要突破，技術(shù)復(fù)雜，檢測費用較高，假陰性和假陽性的比例較高，缺乏精度，還有待于進一步改進，目前還不能廣泛用于糞大腸菌群的日常檢測。ＦＩＳＨ 技術(shù)是細胞水平上的一
種高度專一性檢測方法。它可以在８ｈ內(nèi)給出定量檢測結(jié)果，有極低的假陽性和假陰性的比例。但其操作步驟較煩瑣，技術(shù)復(fù)雜，目前僅可以對水樣中低濃度菌群進行計數(shù)，不利于大規(guī)模推廣，因此ＦＩＳＨ技術(shù)沒有廣泛用于糞大腸菌群的常規(guī)監(jiān)測。
３ 各種檢測方法的應(yīng)用
多管發(fā)酵法和濾膜法是糞大腸菌群標準檢測方法，是常規(guī)監(jiān)測中的主要檢測方法，本文主要介紹其它幾種方法的應(yīng)用。
３．１ 紙片法
紙片法是中國環(huán)境監(jiān)測總站推薦的試用方法，適宜污染事故應(yīng)急監(jiān)測，在食品行業(yè)和食具**效果中廣泛應(yīng)用。頓玉慧［２］使用３ＭＰｅｔｒｉｆｉｌｍ腸桿菌科檢測紙片計數(shù)溫州七里港口水域中的腸桿菌科，并同ＳＮ 方法進行檢測比對，結(jié)果證明使用３ＭＰｅｔｒｉｆｉｌｍ 檢測片來檢測水域中的腸桿菌科是可行的，２種方法檢測的結(jié)果差異不顯著。趙凌宇［３］采集蘇州具有代表性的地表水水體２２個點位的樣品，進行糞大腸菌群的測定方法比較，認為紙片法適于測定受糞便污染程度較輕的湖泊水體。但是，該方法的培養(yǎng)時間對
陽性管率有明顯影響，認為１６～１８ｈ是比較理想的培養(yǎng)時間。趙春霞［４］用多管發(fā)酵法與快速紙片法進行標準菌株和環(huán)境水樣的對比，認為紙片法操作和結(jié)果判斷均較容易，精密度判斷值Ｒ＝０．２１９ ５，在受控范圍內(nèi)，與多管發(fā)酵法的相關(guān)性也很好（ｒ＝
０．９３）。林彩華［５］將３Ｍ Ｐｅｔｒｉｆｉｌｍ 法應(yīng)用于出口水產(chǎn)品的檢測，認為３ＭＰｅｔｒｉｆｉｌｍ法檢測大腸菌群的靈敏度不夠，無法檢測每克樣品含菌量１０個以下。孔梅［６］利用紙片法對食具**效果進行檢測，對出現(xiàn)可疑結(jié)果的紙片放入乳糖膽鹽培養(yǎng)液中再按常規(guī)發(fā)酵法的程序進行大腸菌群檢測，可提高紙片法的靈敏度，增加與常規(guī)發(fā)酵法的陽性符合率。２００８年綠洲生化致病菌測試片系列產(chǎn)品在北京奧運會食品**保障和抗震救災(zāi)中，成為衛(wèi)生部指定采購產(chǎn)品；２００９年病原微生物測試片項目被列入科技部科技型中小企業(yè)技術(shù)**基金項目；２０１０年上海世博會和廣州亞運會中，微生物快速檢驗產(chǎn)品進一步得到成功應(yīng)用。
３．２ 酶底物法
酶底物法已經(jīng)被世界各國國家及地方實驗室和世界各組織機構(gòu)認可，能夠較**地判斷水樣的微生物污染狀況，廣泛用于糞大腸菌群的日常檢測。孫宗科［７］應(yīng)用加標試驗和實際水樣檢測的方式比較酶底物法與多管發(fā)酵法用于水中大腸菌群的檢測方法的優(yōu)劣和結(jié)果的一致性，得出檢測結(jié)果具有一致性（Ｐ＝０１０ ５９），假陽性率無統(tǒng)計學(xué)意義的差別（Ｐ
＝１．０００），可以用作評價水質(zhì)微生物污染的標準方法。趙春霞［４］用標準菌株和環(huán)境水樣進行對比，酶底物法精密度判斷值Ｒ＝０．１３２ ４，在受控范圍內(nèi)，與多管發(fā)酵法也具有良好的相關(guān)性（ｒ＝０．８９）。鄭晶［８］用酶底物法檢測蔬菜中大腸菌群，與ＳＮ方法測試結(jié)果較為接近，無明顯的差異。孫錫娟［９］用酶底物快速檢測法檢測糞源性污染的蔬菜樣品，結(jié)果表明該法敏感性及準確性與多管發(fā)酵法相一致。２００８年科立得協(xié)助北京自來水公司、北京環(huán)境監(jiān)測站、中國**預(yù)防控制中心、北京**預(yù)防控制中心、天津**預(yù)防控制中心等完成奧運**供水工作；美國愛德士（ＩＤＥＸＸ）公司科立得試劑在地震災(zāi)區(qū)等條件惡劣地區(qū)仍能**準確檢測居民用水。
３．３ 其它方法
Ｂｅｊ等［１０］將多重ＰＣＲ用于檢測與總大腸菌群相關(guān)的基因序列，這些序列與腸道病原菌包括（Ｅ．ｃｏｌｉ，Ｓａｌｍｏｎｅｉｉａ ｓｐｐ．和Ｓｈｉｇｅｌｌａ ａｐｐ．）有關(guān)。Ｊｕｃｋ等［１１］利用嵌套式ＰＣＲ方法，并改進了Ｂｅｊ等提出的過濾方法，快速檢測水樣中低濃度的Ｅ．ｃｏｌｉ。明鎮(zhèn)寰［１２］對聚合酶鏈式反應(yīng)（ＰＣＲ）快速檢測水體指示菌———大腸菌群和大腸桿菌進行了研究。采用的２對引物分別擴增了Ｌａｃ Ｚ基因的約２６０ｂｐ和Ｕｄｉ Ａ基因的約１５０ｂｐ ＤＮＡ片段。引物Ⅰ和引物Ⅱ*低能分別擴增１０－６μｇ或１０－８μｇ基因組ＤＮＡ。整個檢測工作在采集水樣后５～６ｈ內(nèi)完成。與常規(guī)水質(zhì)檢測法相比，ＰＣＲ法具有快速、準確的特點，是有效監(jiān)測環(huán)境水體指示菌的一種潛在的新方法。Ｒｅｇｎａｕｌｔ等［１３］利用Ｃｏｌｉｎｓｉｔｕ探針檢測了尿、水（河水和生活污水）以及食品中的Ｅ．ｃｏｌｉ和Ｅ．ｆｅｒｇｕｓｏｎｉｉ。該探針對所研究的不同環(huán)境介質(zhì)中的Ｅ．ｃｏｌｉ具有很好的專一性，已經(jīng)成功地應(yīng)用于飲用水樣品中Ｅ．ｃｏｌｉ的檢測。ＦＩＳＨ 方法的優(yōu)點是不可培養(yǎng)的大腸菌群也可以被檢測出，其缺點是死細胞也可能被計數(shù)。因此，利用ＦＩＳＨ 方法對細菌計數(shù)后，尚需對細菌的生理狀態(tài)進行進一步研究。黃小平［１４］應(yīng)用顯色熒光方法檢測牛奶或水中大腸菌群和大腸桿菌，該方法不需驗證步驟，研究過程中沒有發(fā)現(xiàn)假陽性和假陰性現(xiàn)象出現(xiàn)，靈敏度可達到１～５／１００ｍＬ。涂楚國［１５］ 研究出Ｌａｃｔｏｓｅ－__<___o___Ｔｒｙｐｔｏｎｅ－ＳｏｄｉｕｍＤｏｄｅｃｙｌ ｓｕｌｆａｔｅ－Ｔｒａｃｅ Ｅｌｅｍｅｎｔｓ（ＬＴＳＥ）培養(yǎng)基，采用幾種鑒定驗證試驗的ＬＴＳＥ法，用來快速檢測水質(zhì)、食品、冷飲、餐具等各類樣品７０３件，結(jié)果與國標法（ＧＢ）對照總符合率為９９．３％；同時與美國《水和廢水標準檢驗法》（１６版１９８５年）中檢測糞大腸菌群的正式Ａ－１法相比較特異性強，靈敏度高，能提高檢出率，并節(jié)約經(jīng)費。張江龍［１６］利用法國ＣＯＬＩＬＥＲＴＲ３０００大腸桿菌在線自動監(jiān)測儀，檢測到１個或更多大腸桿菌／１００ｍＬ水的時間不足１８ｈ，對于大腸桿菌污染較嚴重的水體來說，數(shù)小時之內(nèi)就能檢測出來，較傳統(tǒng)的實驗室方法，大大縮短了測量時間，而且可以對水體中微生物的性質(zhì)進行長期不間斷的采樣分析；由于ＣＯＬＩＬＥＲＴＲ試劑對大腸桿菌有非常高的選擇性（這點已被世界上許多國家的研究機構(gòu)所證實和認可，并通過了美國ＵＳＥＰＡ 證實且被收錄到美國標準分析方法），該儀器的分析結(jié)果可信度極高。另外一種相對較快的大腸桿菌檢測設(shè)備是**醫(yī)學(xué)科學(xué)院研制的水質(zhì)細菌檢驗箱，其基本原理是使用濾漠－營養(yǎng)墊法，所用的培養(yǎng)基是新研制的改良遠藤培養(yǎng)基，比普通的遠藤培養(yǎng)基能獲得更加滿意的檢驗結(jié)果，尤其是對水中損傷大腸菌的檢驗有較好的效果，６～１５ｈ后可得到糞大腸菌群數(shù)的監(jiān)測結(jié)果；價格也不貴。適用于各級衛(wèi)生防疫部門，水廠及飲水衛(wèi)生檢驗單位、野外工作單位等在實驗室或野外條件下進行水中細菌總數(shù)和大腸菌群的檢驗。
４ 結(jié) 語
目前，大腸菌群檢測方法發(fā)展很快，已提高到分子生物學(xué)水平，使檢測更快速、準確。新檢測技術(shù)的應(yīng)用普及，不僅與操作技術(shù)的簡易程度和**度有關(guān)，也與檢測設(shè)備和試劑的費用高低、對環(huán)境的影響等有關(guān)。因此要實現(xiàn)實際操作應(yīng)用與普及還需要經(jīng)歷一個長期的反復(fù)驗證完善過程，需要不斷改進操作細節(jié)，使新技術(shù)的**度得到認可。紙片法和酶底物法以其操作簡便、檢測周期短，將取代多管發(fā)酵法、濾膜法等傳統(tǒng)方法，尤其是酶底物法采用密封培養(yǎng)技術(shù)，在檢測醫(yī)院污水時可以減少人員接觸而降低檢測人員的致病風(fēng)險，因此具有更強的實用價值和應(yīng)用價值，極有可能在近期成為評價水質(zhì)微生物污染的快速標準檢測方法之一。自動化檢測方法亦將是監(jiān)測工作的發(fā)展方向，在新技術(shù)支持下，**、快速、可靠、環(huán)保、低廉的自動檢測儀器也將會被研發(fā)并得到應(yīng)用與普及。